Fotoferesi extracorporea (ECP): valutazione in vitro della qualità della procedura

Obiettivi: scopo del presente lavoro è stato quello validare la procedura di fotoferesi extracorporea (ECP) offline dopo aggiunta di 8-MOP e irradiamento con UV-A (PUVA) effettuando test funzionali come raccomandato dalle linee guida GITMO/SIdEM. Attualmente non c’è un accordo generale sul protocollo da adottare per la validazione biologica dell'ECP; si richiede infatti che il test sia riproducibile, affidabile e standardizzabile così che possa essere replicato in ogni laboratorio di processazione.
Metodi: in assenza di direttive ed evidenze a supporto dell’ECP, abbiamo scelto di monitorare l’apoptosi cellulare indotta da 8-MPO e irradiazione con UV-A (PUVA), a 1 h, 48 h, 96 h, utilizzando la doppia marcatura con FITC-Annessina V e 7-AAD e conseguente lettura citofluorimetrica.
Risultati: i test funzionali che abbiamo utilizzato in questo studio riproducono in vitro gli effetti dovuti all’attivazione dell’8-MOP. I nostri dati suggeriscono che l’utilizzo della doppia colorazione con FITC-Annessina V e 7-AAD e conseguente lettura citofluorimetrica possa rappresentare un metodo affidabile e riproduci- bile da utilizzare per la validazione biologica dell’ECP.
Conclusioni: il lavoro svolto ci ha permesso di rivedere la nostra procedura di validazione dell’ECP. Adotteremo come test funzionale quello con doppia marcatura FITC-Annessina V e 7-AAD e lettura in citofluorimetria a +48h post PUVA. Il test verrà eseguito su ciascun paziente arruolato, durante le prime due procedure, ad ogni modifica del set utilizzato e ad ogni cambio di lotto dell’8-MOP. Noi non sappiamo quale sia l’impatto che la procedura di ECP possa avere in termini di efficacia clinica o quali delle cellule reinfuse siano biologicamente inattivate o meno attive nel paziente con GvHD. Il follow-up clinico deve rimanere il parametro fondamentale per valutare la risposta al trattamento di ECP perché anche una terapia qualificata diventa clinicamente irrilevante in un paziente che non risponde al tratta- mento.